Флуоресцентный микроскоп (версия Миг)

Флуоресцентный микроскоп Olympus BX61 с цифровым фотоаппаратом

Флуоресцентный микроскоп (лат. fluo — течь, греч. μικρός — маленький и греч. σκοπέω — смотрю) — специализированный оптический микроскоп, предназначенный для изучения свойств органических или неорганических веществ с использованием явления флуоресценции (люминесценции), позволяющий визуализировать невидимые в обычном свете микрообъекты, за счёт их люминесценции. Принцип действия основан на облучении образца ультрафиолетовым светом; дополнительные возможности для исследования биологических структур даёт использование специальных красителей для микроскопии, способных избирательно адсорбироваться на тех или иных органеллах биологического препарата.

Введение

Процесс поглощения энергии фотонов органическими и неорганическими веществами, с последующим испусканием лучей, имеющих иную длину волны, известен как физическое явление флюоресценции (свечения). электронная эмиссия света в данном процессе флюоресценции по времени является одновременной с началом поглощения-возбуждения. При этом испущенные лучи имеют большую длину волны нежели поглощённые (испущенные фотоны имеют меньшую энергию чем поглощенные). В случае, когда время между поглощением и испусканием составляет более микросекунды, процесс называется фосфоресценцией.

Впервые это явление было открыто англичанином Джорджем Топитом в 1852 году. Он заметил, что минеральный флюорит начинал светиться красным светом, после освещения его ультрафиолетовыми лучами света. Исследования, проведенные в ХIX столетии определили, что много веществ: кристаллы, смолы, сырые наркотики, масло, хлорофил, витамины, неорганические вещества, полезные ископаемые и др. флюоресцируют при освещении их лучами ультрафиолетового света. Лишь с 1930 годов началосось использование явления флюоресценции, которое стали применять в биологических исследованиях. Исследуемые элементы материалов, бактерии, болезнетворные микоорганизмы для выявления их в среде обитания стали красить флюорокрасителями. Некоторые красители использовались в микроскопии и были впоследствии главным двигателем в создании метода флюоресцентной микроскопии с разрешением на нанометрическом уровне (1-10нм), откуда пошло Флюоресцентная наноскопия.

Применение светящегося множества флюоромолекул, атомов дало возможность распознать микрочастицы и отдельные клеточные элементы вплоть до одного элемента — молекулы. Несмотря на то, что данный метод не способен передать пространственное изображение всего элемента ниже его предела дифракции, однако метод флюоресцентной наноскопии способен выдать на экран или рассматривать в оптических окулярах микроскопа изображения отдельных молекул в 3D измерении, расположенных в зоне и ниже дифракционного предела. Применение окраски флюорокрасителями молекул, возбуждаемые вместе с самими молулами, например, ультрафиолетовыми лучами света, вызывает эффект возбуждения молекулы, которая испускают трансформированые кванты энергии излучения, достаточные для получения изображений микроэлементов определённой и нужной яркости. Заранее можно планировать выделение нужных молекул за счёт окраски их флюорокрасителями, которые выделяют их при микроскопии.

Основы возбуждения и эмиссии

Мембрана ячейки дрожжей, визуализируемая некоторыми мембранными белками (благодаря адсорбции флюоресцентных маркеров en:RFP и en:GFP. Жёлтый цвет изображения сформирован при оптической суммации совместного излучения обеих маркеров)

В основе Флуоресцентной микроскопии лежит метод, впервые сформулированный и защищённый авторским свидетельством российским физиком Андреем Климовым, позволяющий существенно увеличить разрешение оптических микроскопов. Однако, патент (который оспаривается) принадлежит разработчику и создателю Флуоресцентного микроскопа Штефану Хеллу (Stefan Hell) из Института биофизической химии (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry (Karl Friedrich Bonhoeffer Institute)) — 2006 год. Большинство Флуоресцентных микроскопов предназначены для исследований в отражённом свете.

Эти микроскопы стали важным инструментом в области биологии, открывая возможности для более передовых направлений микроскопии, типа конфокальной микроскопии позволяющий получать изображения не только с поверхности, но и с некоторой глубины образца.

Основная задача флюоресцентного микроскопа состоит в том, чтобы осветить исследуемый объект с должным и определенным диапазоном длин волн, после чего отделить более слабую испускаемую флюоресценцию (спектр видимых лучей) от света возбуждения. В нормально формируемом флюоремикроскопе, именно эмиссионные лучи окрашенных молекул должны попадать в поле зрения глаз или фотодатчика. Важно, чтобы возбуждённые флуоресцентные краски при свечении добавили светимость окрашенных частиц, чтобы они отличались высокой яркостью, контрастностью на тёмном (или чёрном) фоне. Светящиеся микроэлементы за счёт отфильтрованных лучей видимого спектра света становятся видимыми при помощи создания низкой яркости (темноты) фона. Свет возбуждения - как правило в несколько сотен тысяч до миллиона раз более яркий, чем свет, испускаемый флюоресценцией (спектр видимых лучей).

Принцип работы современного флюореомикроскопа

Cхема работы фильтров флюоресцентного микроскопа

Современный флюоремикроскоп рассчитан на применении исследования эпитаксиального слоя методом передачи изображения, созданного и отражённого при флюремикроскопии. Основой конструкции данного микроскопа является возможность применения вертикального потока лучей в диапазоне длин волн ультрафиолетовых, синих или зелёных видимого спектра света, который образуется, передаётся многоспектральными источниками света, например, лампой дуги или другим источником с длиной волны, отфильтрованный фильтром лучей возбуждения. Данный поток лучей, отражаясь от фильтра — дихроического зеркала или светоделителя, проходит через исследуемый образец (цель), обильно его освещая. При отражении и возврате лучей света эмиссии (возбуждения) он проходит через двухцветное зеркало, фильтруется фильтром, который блокирует нежелательные длины волн возбуждения. В данном случае флюоресценция — единственный способ в оптической микроскопии, когда исследуемый образец вслед за возбуждением начинает светиться своим собственным светом. Излучаемый им свет повторно исходит сферически во всех указанных направлениях и не зависит уже от действия источника лучей света возбуждения!

Микроскопия отдельных молекул

В идеальных условиях работы флюоремикроскопа возможно увидеть, зафиксировать одиночные молекулы. Окрашенные, возбуждённые одиночные молекулы при эмиссии возможно при низких величинах оптического фона и шума фотодатчика отфильтровать слабые видимые лучи, которые улавливаются фотодатчиком и фокусируются на темном фоне в фокальной плоскости, что позволяет их визуально рассматривать. Единственная молекула способна испустить 300000 фотонов до разрушения, фотоотбеливания, что достаточно для её фиксации.

Современный флюоресцентный микроскоп работает в сочетании эффективности оптического метода микроскопии с элементами компьютеризованного контроля систем микроcкопа и систем создания цифрового изображения АЦП, позволяющего шире использовать визуальное наблюдение изображений с оцифровкой, преобразованием их в стереоизображения в виде файлов с выходом на экраны монитора.

Усовершенствования и достижения оптической микроскопии в сочетании с флюоресцентной привели к возможности управлять подклеточными структурами или частицами благодаря и в силу использования широкого диапазона спектроскопических величин.

Способ флюоремикроскопии — получения изображения в габаритах традиционного лабораторного оптического микроскопа и содержит:

• Оптическую стереосистему для визуального наблюдения и проецирования изображения образца на видеокамеру, способную регистрировать и оцифровывать с низким уровнем шума изображения одиночных флуоресцирующих молекул и наночастиц;
• Компьютер для записи и обработки изображений;
• Держатель образца, расположенный напротив объектива;
• Источник возбуждения флуоресцентного излучения;
• Набор сменных фильтров, отбирающих и запирающих исходящие лучи фотонов: дихроических зеркал, дихроических фильтров для выделения видимого спектра света из флуоресценции образца.

Способ отличается тем, что в разных участках объекта периодически создаются видимые раздельно флуоресцирующие молекулы и наночастицы. Лазер обеспечивает такое их возбуждение, которое достаточно не только для регистрации их не перекрывающихся изображений, но и для обесцвечивания уже зарегистрированных флуоресцирующих молекул. При этом десятки тысяч кадров с зарегистрированными изображениями одиночных молекул и наночастиц (в виде пятен диаметром порядка длины волны света флюоресценции, умноженной на увеличение микроскопа), обрабатываются на компьютере для поиска координат центров пятен и создания изображения объекта по миллионам вычисленных координат центров пятен, соответствующих координатам индивидуальных флуоресцирующих молекул и наночастиц.

Технические данные:

• Обеспечивается возможность получения двух- и трехмерного изображения 3D с разрешением 1-10 нм.
• Иметcя возможность регистрации цветного изображения при прокраске различными красителями белков, нуклеиновых кислот, липидов.

Флюоресцентный микроскоп — инструмент с уникальными возможностями для гистологического исследования тканей человека, животных и растений. Он используется для проведения иммунохимических, иммунологических, иммуноморфологических и иммуногенетических исследований.

Вообще, основной принцип работы флуоресцентного микроскопа заключается в облучении образца заданной определенной полосой длин волн, вызывающих флуоресценцию образца. Далее необходимо выделить намного более слабое излучение флуоресценции. В идеально настроенном микроскопе, только свет от флуоресценции должен достичь глаза исследователя или детектора так, чтобы в результате флуоресцентные структуры выделялись с высокой контрастностью на очень темном (или черном) фоне. Проблема состоит в том, что свет возбуждения, как правило, в несколько сотен тысяч, а иногда и в миллион раз ярче, чем свет излучаемой флуоресценции в связи с красителями. Применяемые фильтры, используя кратковременность мощной флюоресценции красителей и более меньшую скорость более слабой флюоресценции исследуемого образца живого белка (например, среза сетчатки глаза цыплёнка), получают изображения, например, колбочек и палочек в цвете, объёме на высоком молекулярном уровне. На рисунке показана схема (в разрезе) современного флуоресцентного микроскопа для проведения исследований в проходящем и отражённом свете.

Устройство флуоресцентного микроскопа

Устройство флуоресцентного микроскопа Olympus BX 51 для исследования образцов методом эпи-флуоресценции в проходящем и отражённом свете — объединение широкого поля эпи-флуоресценции изображения с восстановительной деконволюцией изображения.

Схема устройства люминесцентного микроскопа.
Ультрафиолетовое излучение от источника света (ртутная или ксеноновая лампа) через фильтр, отсекающий видимые лучи, с помощью полупрозрачного зеркала направляется на объект. Возникшее в отдельных структурах объекта видимое излучение возвращается от него к наблюдателю по пути: объектив - полупрозрачное зеркало - ультрафиолетовый фильтр - окуляр - цифровой фотоаппарат (либо видеокамера, глаз).

Флуоресцентный микроскоп содержит один, либо несколько источников ультрафиолетового или синего света. Поглощая это излучение, отдельные структурные элементы образца испускает видимый свет благодаря собственной люминесценции или излучения от флюоресцентных красителей - маркеров, способных адсорбироваться на тех или иных тканях (например на мембранных белках, отдельных хромосомах и т.д.).

Применение

Флюоресцентный микроскоп — инструмент с уникальными возможностями для гистологического исследования тканей человека, животных и растений. Он используется для проведения иммунохимических, иммунологических, иммуноморфологических и иммуногенетических исследований.

Благодаря своим возможностям и техническим характеристикам, люминесцентные микроскопы нашли широкое применение в фармацевтической промышленности, ветеринарии, растениеводстве, в биотехнологии. Люминесцентные микроскопы, работающие по принципу прямого отражения, практически незаменимы при проведении криминалистических экспертиз и санитарно-эпидемиологических исследований.

Флюоресцентные микроскопы, выпускаемые до недавнего времени, обладали одним достаточно серьёзным недостатком: они были громоздкими и тяжёлыми. Использование при проведении современных исследований специальных флюоресцирующих и ферментных меток позволило значительно уменьшить размеры люминесцентных микроскопов, сделать их лёгкими и компактными. Совмещение классического люминесцентного микроскопа с возможностями цифровых технологий позволило наделить их большими возможностями, фиксировать результаты наблюдений и сохранять их в цифровом формате.

Основными областями применения флюоресцентных микроскопов (в которых они просто незаменимы) являются следующие:

• диагностика бактериальных, вирусных и других инфекций антигенного состава
• анализ клеток крови костного мозга
• гистологические исследования живых клеток сетчатки глаза. Например,
  

  Рис.1 На снимке, полученном на флюоресцентном микроскопе все данные колбочек и палочек в объёме и цвете. Жировые капельки (нефтяные капельки) определяют классификацию фоторецепторов колбочек цыпленка в цвете. Палочки безцветны, т.к. они не участвуют в цветном зрении.
  

  Даны типы фоторецепторов колбочек в цвете в типичных отношениях Цветное зрение у птиц (версия Миг).
  Цветное зрение у птиц (версия Миг), где (исследования проводились недавно,в 2006-2009г.г.), где благодаря применению нового флюоресцентного микроскопа с разрешением в 1нм были получены цветные стереоизображения разных колбочек и палочек, воспринимающих фиолетовые, синие, зелёные и красные лучи цвета, что подтверждает теории трихроматик, четырехроматик и более восприятия цвета колбочками. Очень важно, что каждый фоторецептор цветного зрения — колбочка чувствительна к одному цветовому спектру, например, у человека — трихроматик — три колбочки в ячейке к основным «цветам» RGB (см. Трихроматизм (цветное зрение), Теория многокомпонентного цветного зрения).

Галерея

• 

  Эпифлюоресцентное изображение трёх компонентов делящейся раковой ткани человека. ДНК светится синим, a белок en:INCENP - зелёным, микротубулы - красным.

• 

  Эндотелиальные клетки. Клетки эндотелия лёгочной артериибыка (Bovine pulmonary artery endothelial cells- BPAE)

• 

  Лимфоцит человека

• 

  Нуклеус опухолевой клетки костной ткани.

• 

  Идентификация отдельных молекул en:YFP в опухолевой клетке человека. Измеряемое расстояние 15 нм (стандартное отклонение 5 нм).

• 

  Гистология колбочек и палочек цыплёнка при флюоресцентной микроскопии.

См. также

• Микроскопия
• Трихроматизм
• Цветное зрение у птиц (версия Миг)
• Теории цветного зрения (версия Миг)
• Теория трёхкомпонентного цветного зрения (версия Миг)

Литература

На английском языке

• Herman, B., Fluorescence Microscopy., 2nd edition, Taylor & Francis, New York (1998).
• Bradbury, S. and Evennett, P., Fluorescence microscopy., Contrast Techniques in Light Microscopy., BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford, United Kingdom (1996).
• Rost, F., Quantitative fluorescence microscopy. Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom (1991).
• Rost, F., Fluorescence microscopy. Vol. I. Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom (1992). Reprinted with update, 1996.
• Rost, F., Fluorescence microscopy. Vol. II. Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom (1995).
• Rost, F. and Oldfield, R., Fluorescence microscopy., Photography with a Microscope, Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom (2000).

Внешние ссылки

• The Nikon Fluorescence Microscopy Digital Image Gallery - Отличный сайт фирмы Никон по гистологическим иследованиям, с серией микрофотографий биологических тканей, сделанным с помощью люминесцентного (флюоресцентного) микроскопа
• Fluorophores.org - Database of fluorescent dyes - База данных красителей для люминесцентной микроскопии.