Цветные реакции для определения грибов

Материал из свободной русской энциклопедии «Традиция»
Перейти к: навигация, поиск
Icons-mini-icon 2main.png Основная статья: Цветные реакции

Химические цветные реакции — один из методов идентификации грибов, прежде всего макромицетов. Химический метод исследования, основанный на наблюдениях изменений окраски различных макро- и микроскопических структур грибов под действием реактивов используется при идентификации образцов, в том числе для различения таксономических групп.

Таксономическим признаком может служить как положительный или отрицательный результат химического исследования, так и вариации в изменении окраски при положительных реакциях, поскольку один и тот же реактив может давать разное окрашивание у разных видов грибов.

Могут проводиться простые тесты по выявлению характерных реакций мякоти плодового тела в целом или микроскопические исследования, обнаруживающие цветные реакции гиф, спор, базидий и других элементов трамы или мицелия (см. Красители для микроскопии).

Исследования могут проводиться на свежесобранных экземплярах грибов, а некоторые и на гербарных образцах.

Значение и история метода[править]

Макроскопические признаки плодовых тел, а иногда и признаки, обнаруживаемые при микроскопическом исследовании могут быть недостаточными для однозначного определения. В таких случаях используют цветные химические реакции как дополнительный критерий таксонов.

Вильям Нюландер (1822—1899), финский ботаник и энтомолог, первооткрыватель химического метода исследования грибов

Применяемые аналитические реактивы в большинстве случаев не являются специфическими для определённых веществ или комплексов веществ, содержащихся в грибах, однако они часто оказываются специфичными для определённых таксонов грибов, что и позволяет широко использовать метод. Некоторые из используемых реакций являются специфическими, например, положительная реакция с бензидином и α-нафтолом указывает на наличие в мякоти гриба фермента лакказы, с фенолом — тирозиназы, а тест на амилоидность позволяет не только определить наличие в клетках специфичных полисахаридов (глюканов), но и сделать определённые выводы о строении их макромолекул.

Впервые химический метод был применён в 1866 году финским ботаником Вильямом Нюландером (1822—1899) для систематики лишайников. Нюландер заметил, что разные виды по-разному реагируют на воздействие растворами щелочей, гипохлоритов, иода, солей железа и другими реактивами.

Позже Мюллер изучал действие химических реактивов на полипоровые грибы и обнаружил появление фиолетовой окраски у Hapalopilus nidulans, Харлей открыл исчезновение фиолетовой окраски мякоти груздя чёрного под действием щёлочи. В течение всего XX века действие химических реактивов на грибы изучалось многими известными микологами (В. Мельцер, 1924; Ю. Шеффер и Ф. Мёллер, 1938; Р. Кюнер и А. Романьези, 1953; Р. Зингер, 1951, 1962, 1969, 1975; А. Майкснер, 1975; С. П. Вассер, 1980, 1992). Наиболее полные данные о химических цветовых реакциях баздиальных грибов содержатся в работах Кюнера и Романьези, Зингера (1975), Майкснера, Вассера. Для лишайников химический метод углублённо изучался в 1930-х годах японским микологом Я. Асахиной[1] и подробно описан А. Н. Окснером.[2]

В отношении самого́ химического метода среди микологов существуют два противоположных мнения:

  • На основании только химических реакций описываются новые таксоны, иногда даже роды, при этом совершенно не учитываются другие критерии, особенно условия произрастания грибов.
  • Некоторые же учёные не придают значения методу как дополнительному критерию таксонов.

С. П. Вассер[3] приводит две цитаты, характеризующие оба существующих подхода:

Время от времени делаются попытки использования химических опытов для определения видов грибов и лишайников, что часто вызывает бурю протестов. Однако в группе, которая представляет трудность для классификации и количество признаков которой невелико или, наоборот, очень разнообразно, поступление дополнительных сведений должно только приветствоваться.

— А. Берджес[4]

Химический метод как один из удобных, быстрых и надёжных, как дающий дополнительную информацию в суждениях о виде и других таксонах, следует широко использовать, но непременно вместе с другими методами систематики, особенно морфологическими.

— А. Н. Окснер, Определитель лишайников СССР. Морфология, систематика и географическое распространение[5]

Часто используемые реактивы[править]

Результаты исследования часто записываются в кратком виде с использованием химических формул (для неорганических реактивов) или сокращённых обозначений, которые могут различаться у разных авторов, поэтому в публикациях приводятся списки условных обозначений. В зависимости от применимости реакции к данной таксономической группе, может указываться только положителный или отрицательный результат (например, запись «KOH+»/«KOH-» означает положительную/отрицательную реакцию со щёлочью) или указывается изменение окраски (например, «KOH+ желтеет»). Также указывается часть плодового тела или определённая микроструктура, если действие реагента неодинаково для разных структур гриба.[6][7]

  • Аммиак NH3 или NH4OH (25%-ный водный раствор или пары́ нашатырного спирта) у агариковых грибов даёт зелёное, реже жёлтое окрашивание[8], у других базидиомицетов может появляться розоватая, оливковая, фиолетовая, серовато-чёрная окраска.[9] В лихенологии применяется редко.[10]
  • Анилин C6H5NH2 применяется в чистом виде или в виде 50%-ной водной эмульсии, сокращённо обозначается «А». При положительной реакции у базидиомицетов даёт красноватое, медно-красное, жёлтое, жёлто-оранжевое, тёмно-коричневое или оливковое окрашивание.[9][3]
  • Ароматические диамины
    • Бензидин 4,4'-(C6H4NH2)2 в виде спиртового раствора даёт голубую окраску, свидетельствующую о наличии лакказы. Реагент является сильным канцерогеном, поэтому его на практике заменяют орто-толидином (диметилбензидином), который значительно менее опасен и даёт ту же реакцию, что было показано в работе Х. Клеменсона [Clemençon, Schweiz. Zeitschr. f.Pilzk., 1969, 47].[3]
    • пара-Фенилендиамин 1,4-C6H4(NH2)2 может обозначаться как P или Pd, используется в виде 2 % спиртового или 1 % водного ратвора, в 1934 году этот реагент был введён в практику лихенологии Я. Асахиной. В присутствии кислорода воздуха растворы п-фенилендиамина быстро окисляются и приходят в негодность, поэтому перед использованием их проверяют на образце «оленьего мха» Cladonia rangiferina, который даёт интенсивную красную окраску. Для предохранения реактива от окисления в водный раствор добавляют 10 % сульфита натрия. Такой раствор, называемый реактивом Штейнера, сохраняется значительно дольше.[10]
  • Гваякол (спиртовой раствор или настойка семян растения Guajacum officinale) даёт окрашивание в голубовато-зелёные, голубовато-серые, оливковые или красно-коричневые тона.
  • Концентрированные растворы кислот могут давать различные цветовые реакции, используются на свежем материале:
  • Лактофенол — смесь равных частей молочной кислоты и фенола, при положительной реакции даёт окрашивание коричневых, розово-фиолетовых, лиловых, красноватых оттенков.
  • Карболовая кислота (2,5 % раствор фенола) даёт красноватую, желтоватую, коричневую или фиолетовую окраску. Реакция считается положительной, если окраска появляется в течение 20 минут.
  • α-Нафтол (водно-спиртовой раствор) окрашивает в фиолетовый или красноватый цвет, реакция проходит за 2—4 минуты.
  • Пирамидон (водный раствор) даёт реакцию с окрашиванием в сиренево-фиолетовый цвет.
  • Пирогаллол (спиртовой раствор) окрашивает в коричневые тона.
  • Сульфованилин — раствор 1 г ванилина в смеси 8 мл концентрированной серной кислоты и 3 мл дистиллированной воды на свежем материале даёт окрашивание в пурпурные, коричневые, розово-фиолетовые цвета. Впервые применён Арнуольдом и Горисом в 1907 году.
  • Сульфоформалин — смесь формалина и 60—70%-ной серной кислоты. Используется на свежем материале и на образцах, хранившихся в формалине не более 6 месяцев. При положительной реакции медленно появляется коричневое окрашивание.
  • Феноланилин — смесь 3 капель анилина, 5 капель концентрированной серной кислоты и 10 мл карболовой кислоты. Положительная реакция заключается в появлении окраски ржаво-розового, пурпурно-красного или лилово-розового цвета, который затем переходит в шоколадно-коричневый.
  • Формалин окрашивает в фиолетово-коричневый или красноватый цвет.
  • 10 % раствор хлорида железа (III) даёт зеленоватое окрашивание, затем переходящее в тёмно-серый цвет.
  • 10 % раствор сульфата железа (II) с добавлением серной кислоты окрашивает мякоть в зелёный, оливковый, оранжевый или коричневый цвет.
  • Растворы щелочей (гидроксида калия или натрия) дают окрашивание в розовый, жёлтый, красно-коричневый или оранжевый цвет, реакция пригодна и для гербарного материала. Почернение бурой мякоти некоторых трутовиковых грибов под действием щёлочи называют ксантохроидной реакцией.[11]

Макрореагенты[править]

Реагенты — основания[править]

Растворы щелочей (20-30 % раствор едкого натра (NaOH) или едкого кали (KOH)) и растворы аммиака (NH4OH)

Specie Parte che si colora Come si colora
Russula foetens Tutto Crema-pallido
Russula subfoetens Tutto Giallo-cromo istantaneo
Bolelus sibiricus Carne Rosa

Nella seguente tabella sono riportate le principali reazioni con ammonio.

Specie Parte che si colora Come si colora
Boletus spadiceus Cappello Subito verde-azzurro
Cortinarius inamoenus Carne Giallo-vivo
Cortinarius latus Carne Giallo-vivo
Cortinarius largus Carne Giallo-vivo
Cortinarius variecolor Carne Giallo-vivo
Cortinarius nemorensis Carne Giallo-vivo
Cortinarius balteatus Carne Bruna a bordo giallo
Cortinarius subbalteatus Carne Bruna a bordo giallo
Cortinarius balteatocumatilis Carne Bruna a bordo giallo
Cortinarius crassus Carne Bruna a bordo giallo
Cortinarius pseudocrassus Carne Bruna a bordo giallo
Cortinarius balteatoalbus Carne Bruna a bordo giallo
Cortinarius orichalceus Carne Verde
Cortinarius prasinus Carne Verde
Cortinarius xanthophyllus Carne Verde
Cortinarius dibaphus Carne Rosa-rosso
Cortinarius arcuatorum Carne Rosa-rosso
Cortinarius fulvoincarnatus Carne Rosa-rosso
Phylloporus rodoxanthus Carne Blu
Lepiota badhamii Lamelle Verdi
Lactarius turpis Carne Porpora
Russula sardonia Tutto Rosa
Russula virescens Base del Gambo Rosso-arancio
Botetus satanas Pori Verdastri
Russula cavipes Tutto Rosa

Кислоты[править]

Растворы серной кислоты (H2SO4) и азотной кислоты (HNO3)

Specie Parte che si colora Come si colora
Boletus plorans Pori Gialli
Boletus subtomentosus Carne Rosso

Соли железа[править]

  • Растворы солей Fe(II): (FeSO4), in cristalli o in soluzione acquosa al 10 % è impiegato per le Russule;
  • Растворы солей Fe(III): (Fe2Cl6), in soluzione acquosa al 20 %, è impiegato con i Cortinari.
Specie Parte che si colora Come si colora
Amanita pantherina var. abietum Carne Grigio-verde poi rosa, infine rosso-bruno
Clitocybe connata Lamelle Violette
Lactarius volemus Carne Verde
Russula vesca Tutto Ocra-arancio vivace
Russula grisea Tutto Rosa-arancio
Russula alutacea Tutto Arancio
Russula aurata Tutto Giallo-arancio debole
Russula delica Tutto Giallo-arancio
Russula nigricans Tutto Verde scuro
Russula albonigra Tutto Rosa-Carnernicino chiaro
Russula adusta Tutto Arancio, poi oliva
Russula agrifolia Tutto Arancio pallido, poi grigio-verde
Russula densifolia Tutto Verde-oliva
Russula mustelina Tutto Arancio-bruno vivo
Russula medullata Tutto Arancio-pallido
Russula ochroleuca Tutto Arancio-pallido
Russula luteotacta Tutto Grigio-arancio debole
Russula pseudointegra Tutto Ocra-pallido
Russula liliacea Tutto Rosso-pallido
Russula chamaleontina Tutto Grigiastra
Russula vitellina Tutto Rosa
Russula font-queri Tutto Giallo-arancio
Russula nauseosa Tutto Rosa
Russula faginea Tutto Verde istantaneo
Russula xerampelina Tutto Verde-scuro intenso
Russula graveolens Tutto Verde-scuro
Russula cicatricata Tutto Verde-bronzo
Russula cerulea Tutto Arancio
Botetus oxidabile Carne Verde-giallo
Boletus holopus Carne Grigia
Boletus duriusculus Carne Verde-scuro
Botetus scaber Carne Grigio-blu
Boletus griseus Carne Verde-scuro o grigio-azzurra
Russula heterophylla Tutto Rosa-arancio
Russula olivacea Tutto Arancio-vivo
Russula rubroalba Tutto Giallo-arancio
Russula romellii Tutto Arancio-pallido
Russula amoenicolor Tutto Arancio-pallido

Реактив с таллием (Tl-4)[править]

È impiegato per lo studio dei Cortinari ma dà reazioni utili anche con altri funghi. Il Tl-4 si prepara come segue: si scioglie 1g di ossido di tallio in acido nitrico (4 cc) e acido cloridrico concentrati (4 cc), alla soluzione si aggiunge, un po' alla volta e osservando la massima cautela, 1 g di bicarbonato di sodio. Se positive da colorazioni gialle, rosse, verdastre o viola.

Фенол[править]

2 % раствор фенола

Specie Parte che si colora Come si colora
Amanita pantherina Carne Rosso-vinato
Amanitopsis fulva Carne e Gambo Bruno-cioccolato
Amanitopsis crocera Carne e Gambo Rosso-vinoso
Russula integra Tutto Bruno-cioccolato
Russula olivacea Tutto Viola-porpora vivace
Russula rubroalba Tutto Rosso-scuro
Russula curtipes Tutto Bruno-chiaro
Russula romellii Tutto Bruno-ciccolato
Russula pseudodelica Tutto Bruno-lilla
Russula amoena Tutto Violetto-vinato
Russula amoenicolor Tutto Bruno-vinato lento
Russula violeipes Tutto Bruno-cioccolato lento
Russula ilicis Tutto Bruno-porpora

Анилин[править]

L’olio di anilina passato sulla cuticola permette di distinguere i prataioli in due grossi gruppi, a seconda se reagiscono in giallo o no. La traccia dell’anilina intersecata con una di acido nitrico concentrato può dare un’importante reazione, colorata in giallo arancio, denominata «reazione incrociata di Schaeffer». Mescolando qualche goccia di olio di anilina in acqua si ottiene l’acqua di anilina, un reattivo importante per le Russule.

«Феноланилин»[править]

È un reagente impiegato per saggio sui Cortinari e se positiva da reazioni lente con colorazioni rosse. Si prepara aggiungendo 3 gocce di olio di anilina a 5 gocce di acido solforico concentrato e mescolando il tutto con 10 ml di fenolo al 2 %.

Раствор Люголя[править]

Soluzione acquosa iodata impiegata per individuare i funghi con carne o elementi amiloidi, cioè che reagiscono in blu-viola come l'amido. È composto da 1 g di iodio , 2 g di ioduro di potassio (KI) sciolti in 150—200 ml di acqua distillata. È utilizzato per saggi sui Cortinari.

Reattivi fenolossidasici[править]

Non sono sempre specifici, ma danno delle reazioni colorate con la carne dei funghi.

Specie Parte che si colora Come si colora
Russula heterophylla Tutto Bruno-scuro
Russula virescens Tutto Rosso-vinoso intenso
Russula pseudodelica Tutto Blu-verde
Russula violeipes Tutto Blu-verde
Russula fragilis Tutto Verdastra
Russula rhodopoda Tutto Blu-nero intenso
Russula unicolor Tutto Blu-vivace

Другие методики[править]

Тест на амилоидность[править]

Амилоидностью называют способность структур окрашиваться под действием растворов иода. Обычно применяется реактив Мельцера: к водному раствору, содержащему 2,5 % иода и 7,5 % иодида калия добавляют равный объём хлоралгидрата. Реакция применяется как макроскопическая и для окрашивания препаратов при микроскопировании, что даёт возможность определить амилоидность различных структур: спор, гиф, базидий. Амилоидность проявляется и у образцов, длительное время (более 100 лет) хранившихся в гербарии (по данным Зингера, 1975).[8] Наличие и степень амилоидности позволяет определить особенности строения молекул глюканов — полисахаридов, сходных с крахмалом, а также мощность глюканового слоя на поверхности микроскопических структур гриба. Иод адсорбируется в случае сильно развитого поверхностного слоя в каналах между глюкановыми цепочками. Если цепочки сильно разветвлённые, реакция даёт жёлто-коричневую окраску, при наличии менее разветвлённых цепочек проявляется собственно амилоидная реакция — интенсивное посинение, аналогичное известной в аналитической химии иодокрахмальной реакции. Обычно различают структуры неамилоидные (не окрашиваются), декстриноидные, или псевдоамилоидные (окрашиваются в жёлтые и коричневые тона) и амилоидные (окрашиваются в голубой, синий, до почти чёрного).[12]

В 2005 г. В. А. Спириным и соавторами[13] предложено определять степени градации этой реакции в соответствии со шкалой цветов (в скобках — обозначение цвета по шкале Й. Петерсена [Petersen, 1996]):

  • слабодекстриноидная — от бледно-коричневого (P14) до бледно-оливкового (P16)
  • декстриноидная — желтовато-бурый (P9)
  • сильнодекстриноидная — оранжево-бурый (P7)
  • неясно-амилоидная — от бледно-мышино-серого (P53) до бледно-фиолетово-серого (P59)
  • слабоамилоидная — мышино-серый (P55)
  • амилоидная — от голубовато-серого (P57) до тёмно-голубовато-серого (P56)
  • сильноамилоидная — от винно-серого (P58) до серовато-фиолетового (P44)

Реакция Шеффера[править]

Перекрёстная реакция Шеффера: стеклянной палочкой наносят на срез полоску раствора анилина, а затем, пересекая её, полоску 65%-ной азотной кислоты. При положительной реакции в месте пересечения появляется хромово-жёлтое пятно, затем окраска переходит в оранжево-красную. Реакция Шеффера — важный внутриродовой признак для рода Agaricus. Пригодна для материала, длительно хранившегося в гербарии. Открыта Ю. Шеффером в 1933 г.[8]

Красители для микроскопии[править]

Icons-mini-icon 2main.png Основная статья: Красители для микроскопии

Окрашивание органическими красителями применяется как для улучшения оптических свойств микроскопических препаратов, так и для характеристики окрашенных структур. Например, при окрашивании толуидиновыми красителями (крезил синий) различают цианофилию — синеватое окрашивание и метахромазию — красновато-розовое или красновато-фиолетовое окрашивание.

Примечания[править]

  1. Окснер, 1974, с. 223
  2. Окснер, 1974, с. 13—14, 209—225, 250—251
  3. а б в Вассер, 1980, с. 44
  4. Вассер цитирует по кн. Singer R. The Agaricales in modern taxonomy. — Vaduz: Cramer, 1975.>
  5. Окснер, 1974, с. 222
  6. Окснер, 1974, с. 250
  7. Вассер, 1980, с. 46-53 (таблица)
  8. а б в Вассер, 1980, с. 54
  9. а б Методы экспериментальной микологии, 1982, с. 474
  10. а б Окснер, 1974, с. 251
  11. Бондарцева М. А., Пармасто Э. Х. Семейства гименохетовые, лахнокладиевые, кониофоровые, щелелистниковые. — Л.: «Наука», 1986. — С. 9.>
  12. Змитрович, 2008, с. 24
  13. W. A. Spirin, I. V. Zmitrovich, V. F. Malysheva Notes on Perenniporiaceae. — St. Petersburg: All-Russian Institute of Plant protection, 2005. — С. 9.> ISSN 1810-9586

Литература[править]

  • Окснер А. Н. Морфология, систематика и географическое распространение. — Л.: «Наука», 1974. — 284 с.>
  • Дудка И. А., Вассер С. П., Элланская Э. А. и др. Методы экспериментальной микологии. Справочник. — Киев: «Наукова думка», 1982. — С. 59, 474—477.>
  • Вассер С. П. Флора грибов Украины. Агариковые грибы. — Киев: «Наукова думка», 1980. — С. 43—55.>
  • Змитрович И. В. Семейства ателиевые и амилокортициевые. — М. — СПб.: Товарищество научных изданий КМК, 2008. — С. 24—25. — ISBN 978-5-87317-561-1>