Участник:Миг/Флюоресцентный микроскоп

Флюоресцентный наномикроскоп

Флюоресцентный микроскоп (флюоресцентный наноскоп)(лат. fluo — течь, греч. μικρός — маленький и греч. σκοπέω — смотрю) — специализированный световой микроскоп, предназначенный для изучения свойств органических или неорганических веществ с использованием явления флюоресценции (люминесценции) с возможностью исследования свечения под действием УФ-излучения, в отражённом или проходящем освещении. Это лабораторная оптическая система для получения увеличенных изображений сверхмалых объектов с разрешающей способностью 1-10нм, с использованием различного характера свечения малых структурных элементов объекта под действием возбуждающего лазерного облучения. Микроскоп используется, например, для исследования живых клеток, с выдачей оцифрованных цветных стереизображений на экран 3D монитора.

• Флюоресцентный микроскоп является современной модификацией более старой конструкции, люминесцентный микроскоп.

В основе микроскопии (наноскопии) лежит новый метод, впервые сформулированный защищённый авторским свидетельсвом по изобретениям российским физиком Андреем Климовым, позволяющий увеличить разрешение оптических микроскопов на два и выше порядков. Однако, патент, который оспаривается, принадлежит разработчикам и создателям флюоресцентного наноскопа Штефану Хеллу (Stefan Hell) из Института биофизической химии (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry (Karl Friedrich Bonhoeffer Institute)) — 2006 год. Большинство микроскопов флюоресценции основаны на использовании возбуждения и наблюдение флюоресценции - сверху . Эти микроскопы стали важной частью в области биологии, открывая двери для более передовых напрвлений микроскопии, типа софокусного лазерного микроскопа просмотра и микроскопа полного внутреннего флюоресцентного отражения. Это микроскопия, объединяющаяся локализации с пространственно смодулированным опорным освещением с использованим стандартных красок флюоресценции и получение оптического изображения (по принципу оптической микроскопии), но c разрешением 1-10нм. (За счёт разделения возбуждающего лазерного опорного освещения и фильтрации более слабых образуемых видимых электромагнитных лучей на атомно-молекуляарном уровне.

Введение

Принцип работы флюоресцентного микроскопа старого образца

Процесс поглощения энергии фотонов органическими и неорганическими веществами, с последующим испусканием лучей, имеющих иную длину волны, известен как физическое явление флюоресценции (свечения). электронная эмиссия света в данном процессе флюоресценции по времени является одновременной с началом поглощения-возбуждения. При этом испущенные лучи имеют большую длину волны нежели поглощённые (испущенные фотоны имеют меньшую энергию чем поглощенные). В случае, когда время между поглощением и испусканием составляет более микросекунды, процесс называется фосфоресценцией.

Впервые это явление было открыто англичанином Джорджем Топитом в 1852 году. Он заметил, что минеральный флюорит начинал светиться красным светом, после освещения его ультрафиолетовыми лучами света. Исследования, проведенные в ХIX столетии определили, что много веществ: кристаллы, смолы, сырые наркотики, масло, хлорофил, витамины, неорганические вещества, полезные ископаемые и др. флюоресцируют при освещении их лучами ультрафиолетового света. Лишь с 1930 годов началосось использование явления флюоресценции, которое стали применять в биологических исследованиях. Исследуемые элементы материалов, бактерии, болезнетворные микоорганизмы для выявления их в среде обитания стали красить флюорокрасителями. Некоторые красители использовались в микроскопии и были впоследствии главным двигателем в создании метода флюоресцентной микроскопии с разрешением на нанометрическом уровне (1-10нм), откуда пошло Флюоресцентная наноскопия.

Применение светящегося множества флюоромолекул, атомов дало возможность распознать микрочастицы и отдельные клеточные элементы вплоть до одного элемента — молекулы. Несмотря на то, что данный метод не способен передать пространственное изображение всего элемента ниже его предела дифракции, однако метод флюоресцентной наноскопии способен выдать на экран или рассматривать в оптических окулярах микроскопа изображения отдельных молекул в 3D измерении, расположенных в зоне и ниже дифракционного предела. Применение окраски флюорокрасителями молекул, возбуждаемые вместе с самими молулами, например, ультрафиолетовыми лучами света, вызывает эффект возбуждения молекулы, которая испускают трансформированые кванты энергии излучения, достаточные для получения изображений микроэлементов определённой и нужной яркости. Заранее можно планировать выделение нужных молекул за счёт окраски их флюорокрасителями, которые выделяют их при микроскопии.

Основы возбуждения и эмиссии

Мембрана ячейки дрожжей, визуализируемая некоторыми мембранными белками (благодаря адсорбции флюоресцентных маркеров en:RFP и en:GFP. Жёлтый цвет изображения сформирован при оптической суммации совместного излучения обеих маркеров)

Основная задача флюоронаноскопа состоит в том, чтобы осветить исследуемый объект с должным и определенным диапазоном длин волн, после чего отделить более слабую испускаемую флюоресценцию (спектр видимых лучей) от света возбуждения. В нормально формируемом флюоромикроскопе, именно эмиссионные лучи окрашенных молекул должны попадать в поле зрения глаз или фотодатчика. Важно, чтобы возбуждённые флуоресцентные краски при свечении добавили светимость окрашенных частиц, чтобы они отличались высокой яркостью, контрастностью на тёмном (или чёрном) фоне. Светящиеся микроэлементы за счёт отфильтрованных лучей видимого спектра света становятся видимыми при помощи создания низкой яркости (темноты) фона. Свет возбуждения - как правило в несколько сотен тысяч до миллиона раз более яркий, чем свет, испускаемый флюоресценцией (спектр видимых лучей).

Принцип работы современного флюоромикроскопа

Cхема работы фильтров флюоресцентного микроскопа

Современный флюоромикроскоп рассчитан на применении исследования эпитаксиального слоя методом передачи изображения, созданного и отражённого при флюромикроскопии. Основой конструкции данного микроскопа является возможность применения вертикального потока лучей в диапазоне длин волн ультрафиолетовых, синих или зелёных лучей видимого спектра света, который образуется, передаётся многоспектральными источниками света, например, лампой дуги или другими источником с длиной волны, отфильтрованный фильтром лучей возбуждения. Данный поток лучей, отражаясь от фильтра — дихроического зеркала или светоделителя, проходит через исследуемый образец (цель), обильно его освещая. При отражении и возврате лучей света эмиссии (возбуждения) он проходит через двуцветное зеркало, фильтруется фильтром, который блокирует нежелательные длины волн возбуждения. В данном случае флюоресценция — единственный способ в оптической микроскопии, когда исследуемый образец вслед за возбуждением начинает светиться своим собственным светом. Излучаемый им свет повторно исходит сферически во всех указанных направлениях и не зависит уже от действия источника лучей света возбуждения.

Микроскопия отдельных молекул

В идеальных условиях работы флюоронаноскопа возможно увидеть, зафиксировать одиночные молекулы. Окрашенные, возбуждённые одиночные молекулы при эмисии возможно при низких величинах оптического фона и шума фотодатчика отфильтровать слабые видимые лучи, которые улавливаются фотодатчиком и фокусируются на темном фоне в фокальной плоскости, что позволяет их визуально рассматривать. Единственная молекула способна испустить 300000 фотонов до разрушения, фотоотбеливания, что достаточно для её фиксации.

Современный флюоресцентный микроскоп работает в сочетании эффективности оптического метода микроскопии с элементами компьютеризованного контроля систем микроcкопа и систем содания цифрового изображения АЦП, позволяющего шире использовать визуальное наблюдение изображений с оцифровкой, преобразованием их в стереоизображения в виде файлов с выходом на экраны монитора.

Усовершенствования и достижения оптической микроскопии в сочетании с флюоресцентной привели к возможности управлять подклеточными структурами или частицами благлдаря и в силу использования широкого диапазона спектроскопических величин.

Способ флюоронаноскопии получения изображения доступен в габаритах традиционного лабораторного оптического микроскопа и содержит:

• Оптическую стереосистему для визуального наблюдения и проецирования изображения образца на видеокамеру, способную регистрировать и оцифровывать с низким уровнем шума изображения одиночных флуоресцирующих молекул и наночастиц;
• Компьютер для записи и обработки изображений;
• Держатель образца, расположенный напротив объектива;
• Источник возбуждения флуоресцентного излучения;
• Набор сменных фильтров, отбирающих и запирающих исходящие лучи фотонов: дихроических зеркал, дихроических фильтров для выделения видимого спектра света из флуоресценции образца.

Способ отличается тем, что в разных участках объекта периодически создаются видимые раздельно флуоресцирующие молекулы и наночастицы. Лазер обеспечивает такое их возбуждение, которое достаточно не только для регистрации их неперекрывающихся изображений, но и для обесцвечивания уже зарегистрированных флуоресцирующих молекул. При этом десятки тысяч кадров с зарегистрированными изображениями одиночных молекул и наночастиц (в виде пятен диаметром порядка длины волны света флюоресцении, умноженной на увеличение микроскопа), обрабатываются на компьютере для поиска координат центров пятен и создания изображения объекта по миллионам вычисленных координат центров пятен, соответствующих координатам индивидуальных флуоресцирующих молекул и наночастиц.

Технические данные:

• Обеспечивается возможность получения двух- и трехмерного изображения 3D с разрешением 1-10 нм.
• Иметcя возможность регистрации цветного изображения при прокраске различными красителями белков, нуклеиновых кислот, липидов.

Люминесцентный микроскоп — инструмент с уникальными возможностями для гистологического исследования тканей человека, животных и растений. Он используется для проведения иммунохимических, иммунологических, иммуноморфологических и иммуногенетических исследований.

Применение

Благодаря своим возможностям и техническим характеристикам, люминесцентные микроскопы нашли широкое применение в фармацевтической промышленности, ветеринарии, растениеводстве, в биотехнологии. Люминесцентные микроскопы, работающие по принципу прямого отражения, практически незаменимы при проведении криминалистических экспертиз и санитарно-эпидемиологических исследований.

Люминесцентные микроскопы, выпускаемые до недавнего времени, обладали одним достаточно серьёзным недостатком: они были громоздкими и тяжёлыми. Использование при проведении современных исследований специальных флюоресцирующих и ферментных меток позволило значительно уменьшить размеры люминесцентных микроскопов, сделать их лёгкими и компактными. Совмещение классического люминесцентного микроскопа с возможностями цифровых технологий позволило наделить их большими возможностями, фиксировать результаты наблюдений и сохранять их в цифровом формате.

Основными областями применения люминесцентных микроскопов (в которых они просто незаменимы) являются следующие:

• диагностика бактериальных, вирусных и других инфекций антигенного состава
• анализ клеток крови костного мозга
• гистологические исследования живых клеток сетчатки глаза. Например,
  

  Даны типы фоторецепторов колбочек в цвете в типичных отношениях Цветное зрение у птиц
  Цветное зрение у птиц (исследования проводились недавно,в 2006-2009г.г.), где благодаря применению нового флюоресцентного микроскопа с разрешением в 1нм были получены цветные стереоизображения разных колбочек и палочек, воспринимающих фиолетовые, синие, зелёные и красные цвета, что подтверждает теорию трихроматизма, и четырехроматизма и более восприятия цвета. Очень важно, что каждый фоторецептор цветного зрения — колбочка чувствительна к одному цветовому спектру, например, у человека — трихроматик — каждая колбочка в блоке из трёх таких же колбочек, накрытых кружком нерезкости сфокусированной предметной точки изображения, выделяет сигнал основного светового луча из трёх RGB. Т.о. три колбочки в блоке работают по принципу трихроматизма. (См. Участник:Миг/Теории цветного зрения, Участник:Миг/Теория трёхкомпонентного цветного зрения).

Галерея

• 

  Эндотелиальные клетки. Клетки эндотелия лёгочной артерии быка (Bovine pulmonary artery endothelial cells- BPAE)

• 

  Лимфоцит человека

• 

  Идентификация отдельных молекул en:YFP в опухолевой клетке человека. Измеряемое расстояние 15 нм (стандартное отклонение 5 нм)

• GFP Superresolution Christoph Cremer.jpg

  Нуклеус опухолевой клетки костной ткани

См. также

• Микроскоп
• Флюоресценция
• Эпитаксия
• Лазерный рентгеновский микроскоп
• 3D-дисплей
• Дихроическое зеркало