Микроскопия
Микроскопия (лат. μΙκροσ — мелкий, маленький и др.-греч. μΙκροσ σκοποσ — вижу) — способ изучения малых объектов с помощью микроскопа. Микроскопия позволяет получить изображения тонкой структуры объектов, качество изображения зависит от разрешающей способности микроскопа.
Микроскопия постоянно развивается с учётом технических достижений в области точной механики и классической оптики, с получением всё более высокой разрешающей способности микроскопов, что даёт возможность исследовать новые материалы, применить новые методы исследований к наноматериалам и т.д. Создание в 1847 году Карлом Цейссом первого опытного однолинзового образца микроскопа открыло эпоху разработок новых конструкций микроскопов, и вслед за этим - новых способов микроскопии. Применение атомно-силового микроскопа в нанотехнологии даёт возможность глубже проникнуть в микромир. С помощью атомно-силовых микроскопов можно управлять атомами и молекулами, что в свою очередь порождает новые методы и технологии дальнейших исследований, ведёт к созданию новых материалов, устройств.
История[править | править код]
Первый микроскоп был создан лишь в 1595 году Захариусом Йансеном. [1] Современные микроскопы отличаются высокой степенью специализации. Существуют металлографические, биологические, полярографические, а также универсальные микроскопы, общего назначения.
Существует несколько видов микроскопии: оптическая микроскопия, электронная микроскопия, рентгеновская микроскопия (рентгеновская лазерная микроскопия), отличающиеся конструктивными элементами, деталями, узлами самих микроскопов, что обеспечивает наблюдение в разных диапазонах спектра электромагнитных лучей.
Каждый из видов микроскопии тесно связан с техническими возможностями соответствующего оборудования (оптическая микроскопия, наноскопия, рентгеновская микроскопия, лазерная рентгеновская микроскопия, электронная микроскопия, сканирующая зондовая микроскопия, сканирующая туннельная микроскопия, ближнепольная оптическая микроскопия).
Все указанные направления имеют комплекс специальных приёмов для подготовки образцов, фиксации объектов исследования, микрофотографирования и видеозаписи, дешифровки изображений. Химическими и физическими методами отдельные элементы изображения могут быть выделены (окрашены, протравлены) или замаскированы, с целью определения тонкой структуры объекта. Существуют методы повышения контрастности и цветовой контрастности изображений, замены цветов для улучшения восприятия структуры собъекта. Разработаны различные компьютерные программы для выделения и подсчёта числа определённых структурных элементов изображения. Возможности микроскопии как метода изучения и фотографирования малых объектов зависят от разрешающей способности, применения новых технологий оптических систем, стереоскопии, методов подготовки объекта (срезы, окрашивание препаратов, использование метода тёмного- и светлого поля, поляризованного света и т.д.). Новые микроскопы расширяют возможности исследований в таких областях наук, как биологии, медицине, металловедении, минералогии, космосе и др..
Разрешающая способность[править | править код]
Получение изображений осуществляется путём использования соответствующих оптических систем — микроскопов. Степень проникновения в микромир зависит от возможности рассмотреть величину микрообъектов, от разрешающей способности прибора , определяемой длиной волны используемого в микроскопии опорного излучения (свет, УФ, ИК, рентгеновское излучение). Главным ограничением возможности рассматривать более мелкие частицы — это когда достигнут предел возможности применить длину опорной (например,размер площади) волны излучения (освещения) объекта меньше его (т.е. внутри его границ). Например, наш глаз способен рассмотреть размер пятен изображения или две риски в пределах 0,176мм c расстояния 250мм. Уменьшение размеров пятен или расстояний между рисками мы воспринимаем как сплошное любое цветное или чёрно-белое (серое) изображение без видимых деталей. Т.е. «проникнуть глубже» в микромир возможно при применении более коротковолновых излучений, т.е. излучений с меньшими длинами волн, соответственно с более высокой разрешающей способностью микроскопов. В настоящее время достигнут предел разрешающей способности микроскопа или микроскопии, равный длине опорной волны луча «жёсткого» рентгеновского излучения, что соответствует длинам волн 1—10нм (10−9—10−8м).[2]
Оптическая микроскопия[править | править код]
- Сравнение возможностей 4-х методов оптической микроскопии (бумага; латеральное разрешение 1.559 мкм/пиксель)
Микрофотография образца рыхлой бумаги (техника тёмного поля - освещение конусом света), изображение формируется светом, отражённым и рассеянным от структурных элементов образца.
Техника светлого поля, изображение формируется благодаря поглощению и рассеиванию света в полупрозрачном материале образца).
Поляризационная микроскопия, контрастность и окраска изображения определяются взаимодействием поляризованного света санизотропными структурными элементами объекта.
Фазовый контраст, контрастность изображения связана с интерференцией лучей света, проходящих через объект.
Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, т. е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм), среднестатистическое нормальное разрешения составляет 0,176 мм (cм. Острота зрения). Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены оптические микроскопы различных типов.
Немецкие ученые Штефан Хелль в 2006 году Stefan Hell и Мариано Босси Mariano Bossi из Института биофизической химии разработали микроскоп под названием Флюоресцентный микроскоп с разрешением в 1-10 нм и дающий возможность получать высококачественные трехмерные 3D изображения. Вся суть заключается в том, что здесь впервые применён принцип комбинированной микроскопии, когда опорное освещение по принципу лазерной рентгеноскопии позволяет получить оптическое изображение с выходными длинами волн видимого спектра оптического микроскопа, и обеспечивать разрешение микроскопии в диапазоне 1-10 нм!
Основные методы исследования[править | править код]
Большинство объектов для оптической микроскопии (например, биологические объекты) имеют прозрачные, полупрозрачные и непрозрачные структурные элементы. Биологические объекты исследуют как в неизменном, живом виде, так и после обработки, прекращающей жизнедеятельность. В последнем случае образцы фиксируют, а затем готовят микроскопический препарат.
Растительные и животные ткани для гистологического исследования можно окрашивать для повышения контрастности и выделения отдельных структурных элементов (см. красители для микроскопии); в некоторых случаях возможна прижизненная окраска препарата. Объекты большой толщины можно разрезать на тонкие слои с помощью микротома.
- Детально методы микроскопических исследований (тёмное и светлое поле, фазовый и интерференционный контраст, микроскопия в поляризованном и ультрафиолетовом свете, приготовление препаратов) отражены в обобщающей статье Техника микроскопических исследований.
Методы исследования в отражённом свете[править | править код]
В отражённом свете исследуют прежде всего металлы и минералы. но также иногда и биологические объекты. Для выявления структуры металлов и сплавов их подвергают селективному травлению.
Методы исследования минералов[править | править код]
Электронная микроскопия[править | править код]
С изобретением электронного микроскопа в 1930-е годы связано начало создания современной науки об исследовании и изучении микромира, под названием микрография.
Рентгеновская микроскопия[править | править код]
История рентгеновской микроскопии[править | править код]
До создания рентгеновских микроскопов работали с оптическими приборами, использующих лучи видимого света, так как и глаз работает в оптическом диапазоне длин волн. Соответственно, оптические микроскопы не могли иметь разрешения менее полупериода волны опорного излучения (для видимого диапазона длина волн 0,4—0,7 мкм, или 400—700 нм) c возможным максимальным увеличением в 2000 раз.[3]
Идея просвечивающего электронного микроскопа состояла в замене опорного электромагнитного излучения на электронный пучок. Известно, что для увеличения разрешения микроскопов, использующих Электромагнитное излучение, необходимо уменьшение длины волны электромагнитного излучения до ультрафиолетового диапазон вплоть до рентгеновского (длина волны сопоставима с межатомными расстояниями в веществе) и основная трудность состоит в фокусировке ультрафиолетовых и, тем более, рентгеновских лучей. Последние вообще не поддаются фокусировке.
Особенность взаимодействия рентгеновских лучей с веществом отличает рентгеновские оптические системы от оптических систем для световых и электронных лучей. (Малое отклонение коэффициента преломления рентгеновских лучей от единицы (меньше чем на 10-4) практически не позволяет использовать для их фокусировки линзы и призмы. Электрические и магнитные линзы для этой цели также неприменимы, так как рентгеновские лучи инертны к электрическому и магнитному полям. Поэтому в микроскопии рентгеновской для фокусировки рентгеновских лучей используют явление их полного внешнего отражения изогнутыми зеркальными плоскостями или отражение от кристаллографических изогнутых плоскостей). На этом принципе построены отражательные рентгеновские микроскопы.
Возможности рентгеновской микроскопии[править | править код]
Разрешающая способность методов рентгеновской микроскопии практически достигает 100 нм, что в 2 раза выше, чем у оптических микроскопов (200нм). Теоретически рентгеновская микроскопия позволяет достичь на 2 порядка лучшего разрешения, чем оптическая (поскольку длина волны рентгеновского излучения меньше на 2 порядка). Однако современный оптический микроскоп - наноскоп имеет разрешение до 3-10 нм.
Проекционные рентгеновские микроскопы[править | править код]
Проекционные рентгеновские микроскопы представляют собой камеру, в противоположных концах которой располагаются источник излучения и регистрирующее устройство. Для получения чёткого изображения необходимо, чтобы угловая апертура источника была как можно меньше.
Увеличение (М) в методе рентгеновской проекционной микроскопии определяется отношением расстояний от источника рентгеновского излучения до детектора (b) к расстоянию от источника до объекта (а):
- М = b/a
В микроскопах такого типа до недавнего времени не использовались дополнительные оптические приборы. Основным способом получить максимальное увеличение является размещение объекта на минимально возможном расстоянии от источника рентгеновского излучения. Для этого фокус трубки располагается непосредственно на окне рентгеновской трубки либо на вершине иглы анода, помещенной вблизи окна трубки. В последнее время ведутся разработки микроскопов, использующих зонные пластинки Френеля для фокусировки изображения. Такие микроскопы имеют разрешающую способность до 30 нанометров.
Новое направление в рентгеноскопии[править | править код]
Рентгеновская оптика преломления[править | править код]
В настоящее время на основе оптических материалов монокристаллического кремния исследованы и созданы линзы и призмы, преломляющие Х-лучи. Это аналоги оптических устройств (тонких линз), используемых в диапазоне видимых лучей света. До последнего времени считались невозможными использовать преломляющие системы для рентгеновского излучения.
Как известно, показатель преломления Х-лучей мало отличается от единицы. Рентгеновская оптика являлась предметом постоянных оценок и рассуждений. Получение и появление составных рентгеновских линз и призм — начало новых шагов во всём мире в деле создания новых оптических устройств микроскопов, телескопов с использованием диапазона спектра длин волн жёстких Х-лучей, способных их преломлять и фокусировать с разрешением 5-10нм[4]
Получение изображений в реальном и фурье-пространствах[править | править код]
Фокусирующие элементы могут передавать рентгеновские изображения в реальном (видимом) пространстве объектов в виде стереоизображений 3D. В данном случае важно при создании методов рентгеноскопии, когда пространственное разрешение фиксируется предельным разрешением сфокусированного объекта на субмикронном атомно-молекулярном уровне. Эти методы уже с 1980 годов реализованы, но в диапазоне «мягких» Х-волн при использовании зонных пластинок Френеля и рентгеновской зеркальной оптикой. В данном случае, например, получают двумерные рентгеновские изображения при использовании мягких Х-лучей с энергией 1-1,5кэВ, где глубина поглощения менее 1мкм, что не на много больше разрешения, т.е. 20-100нм.
В диапазоне жёсткого излучения (мощностью от 6-10 до 100кэВ), где работают преломляющие линзы (Рис. 1, Рис. 2), глубина поглощения достигает величин больших значений разрешения самих линз. Кроме того надо учесть, что преломляющие Х-линзы, дающие субмикронное фокальное пятно, имеют глубину резкости примерно 0,1—1см. И любое двумерное их оптическое изображение есть проекционное с деталями, которыые накладываются по ходу луча. Откуда, наиболее целесообразнее получить объективную оценку, применив способы томографии, компьютерной томографии, магнитно-резонансной томографии.[5], получая изображение в трёхмерном пространстве (3D).
Для получения рентгеновских изображений в действительном пространстве сейчас в основном применяют преломляющие линзы, рассмотренные выше (Рис.1,2), с параболическим аксиально симметричным профилем.[6] Имеются и другие Х-линзы с другими расчётными профилями. В настоящее время опережающее развитие получает безлинзовая компьютерная микроскопия в томографии, где происходит формирование трёхмерных изображений структуры объектов (3D). Сейчас созданы нанотомографы с разрешением 200нм.[7] Для повышения разрешения трехмерных изображений величиной в 25-50нм предполагается применение в топографии методов преобразований сигналов изображений нанообъектов — спектров дифракции в фурье-пространстве (с последующими преобразованиями сигналов — дискретизация, калибровка, восстановление их при АЦП и т.д. с выдачей в стерео пространстве изображений на экране монитора). Флюоресцентная рентгеноскопия с разрешением 5-10нм отличается тем, что в разных участках объекта периодически создаются видимые раздельно флуоресцирующие молекулы и наночастицы. Лазер (рентгеновский) обеспечивает такое их возбуждение, которое достаточно не только для регистрации их неперекрывающихся изображений, но и для обесцвечивания уже зарегистрированных флуоресцирующих молекул. При этом десятки тысяч кадров с зарегистрированными изображениями одиночных молекул и наночастиц (в виде пятен диаметром порядка длины волны света флуоресценции, умноженной на увеличение микроскопа), обрабатываются на компьютере для поиска координат центров пятен и создания изображения объекта по миллионам вычисленных координат центров пятен, соответствующих координатам индивидуальных флуоресцирующих молекул и наночастиц. При этом применяемые две цифровые, размещённые под углом, с высоким разрешением камеры, улавливая светящиеся окрашенные в RGB цвета микрочастицы (молекулы, атомы) при формировании стереоизображений окрашивают их в нужный цвет. [8]
Лазерная рентгеновская микроскопия[править | править код]
См. Лазерный рентгеновский микроскоп
Организации микроскопистов[править | править код]
- Royal Microscopical Society (RMS)
- Microscopy Society of America (MSA)
- European Microscopy Society (EMS)
Примечания[править | править код]
- ↑ http://www.gallery-st.com/texts/mantis.doc
- ↑ http://www.lenta.ru/news/2007/08/13/nanoscope
- ↑ http://materiology.info/ref/opti2eskogo_mikroskopa.html
- ↑ В.В.Аристов, Л.Г.Шабельников Успехи физических наук, январь 2008г.,Том178, №1
- ↑ Тихонов А Н, Арсенин В Я, Тимонов А АМатематические задачи компютерной томографии (М.:Наука,1987)
- ↑ Langeler B et al.J. Sinchrotron Rad. 9 119 (2002)
- ↑ SKYSCAN, httr://www.skyscan.be
- ↑ Darahanau A V et.al. Phys. Lett. A 335 494(2005)
См. также[править | править код]
Литература[править | править код]
- А. М. Василевский, М. А. Кропоткин, В. В. Тихонов. Оптическая электроника. Ленинград,Энергоатомиздат.1990.г. глава 3.