Микроскопия и фоторецепторы сетчатки глаза

Фиг.1.Трихроматизм. После повторных исследований (1966) в 2009 году работы фоторецепторов на живой сетчатке глаза бабуина в своих выводах по теме:Функциональная нейроанатомия сетчатки, Кафедра офтальмологии, Моран глазной центр, Университет штата Юта; Кафедра офтальмологии, доктор Роберт Э. Марк сформулировал принцип трихроматизма — в цветном зрении в условиях дневного освещения работают колбочки RGB (красные, зелёные, синие), (палочки серо-голубые, работают при слабом и ночном освещении и цвета не воспринимают).

Микроскопия сетчатки — исследования сетчатки и её сечений с целью определения её структуры на макро- и микроуровнях, вплоть до молекулярного. Микроскопия проводится в комплексе с гистологическим и генетическим анализом структурных элементов; определеним взаимосвязей нервных клеток, экстерорецепторов сетчатки, изучением мозаики блоков фоторецепторов (рентгеноская и флюоресцентная микроскопия клеток с разрешающей способностью менее 1‒10 нм). Исследования связано в настоящее время с возможностью создания атласа связей всех типов нервных клеток сетчатки и отделов головного мозга (см. коннектомика и Human Connectome Project) на основании микроскопии живых клеток, препаратов, лабораторных животных (кроликов, голубей, черепах, крыс и др.), микроскопии сетчатки глаза и её сечений в комплексе с гистологическим и генетическим анализом структурных элементов.

История

В истории остались многие наивные теории цветового зрения — концепции, объясняющие способность человека различать цвета, основанные на наблюдаемых фактах, предсказательная сила которых была невелика. Даже гениальные предположения учёных прошлого были в основном умозрительны, так как естественные науки прошлого не обладали необходимым инструментарием; не был сформирован понятийный аппарат, невозможно было провести многие критически важные эксперименты. Бурное развитие естественных наук можно отнести к ХIХ веку, когда специалисты в области биологии, химии и физики сделали огромный прорыв в естественных науках.

Рентгеноскопия сетчатки приматов в лаборатории Р.Марка

Доктор Марк (R.E.Marc) Директор исследовательского центра Глаза Moran; Профессор Офтальмологии, Медицинский университет в штате Юта; Профессор неврологии, Университет Техаса / Хьюстон.

Проведенная Р.Марком ещё в 1966 году рентгеноскопия (см. фиг.1) подтверждает ранее сформулированные гипотезы о работе сетчатки, где заложены фоторецепторы колбочки, которые воспринимают, трансдукцируют основные сигналы оптического изображения перед передачей их в высшие зрительные отделы (нейронные) головного мозга. Данная информация позволяет подтвердить основные положения трёхкомпонентной теории цветного зрения (которая во многом не совпадает с нелинейной моделью цветного зрения С. Ременко).

Фиг.1. Структура сетчатки глаза (у приматов) впервые получена в лаборатории доктора Марка в 1966 году и повторно на живых клетках в 2009 году. На фиг.1 получены три вида колбочек: (R-красные, G-зелёные, B-синие), участвующие в дневном, цветном зрении. (Доказан принцип трихроматизма цветного зрения).

В настоящее время уже вообще не стоит вопрос о невозможности восприятии цвета в сетчатке блоками из трёх типов колбочек (R.Marc, 2009)., Группа учёных Лаборатории Марка уже работают над созданием атласа основных нервных клеток сетчатки и отделов головного мозга, на основании микроскопии их у кроликов и крыс. При этом используется разработанная мощная программа обработки данных современных микроскопов и компьютерных систем. При этом открывается возможность визуально анализировать работу здоровых и больных клеток с целью лечения целого ряда болезней (слепота, дальтонизм и др.).,.

Что важно, на фотоснимке рентгеноскопии одного срезов сетчатки видно расположение, мозаику основных фоторецепторы колбочек и палочек их связи с нейронами сетчатки и между собой и самое важное видна их работа в процессе видения в условиях дневного и сумеречного зрения при создании оптического изображения в сетчатке глаза, а также в зрительных отделах головного мозга.

В итоге микроскопии, рентгеноскопии дивых срезов сетчатки получено, что в условиях дневного освещения работают колбочки, в условиях сумеречного и ночного освещения работают палочки. (См. Ретиномоторная реакция фоторецепторов сетчатки глаза).

Флюоресцентная наноскопия сетчатки глаза птиц

На основании срезов живой сетчатки (слои сечений толщиной 10мкм) впервые были получены данные гистологического исследования сечений колбочек, палочек и нейронов сетчатки птичьего глаза (2007). Их исследование проводилось с помощью лабораторного флюоресцентного наноскопа с получением цветных стереофотографий.

На рис. 1 показаны:

• (A) — липофильные капельки окрашены приблизительно, в соответствии с их видом в проходящем свете. Палочки и и один двойник двойных колбочек испытывают недостаток в липидных капельках.
• (A) — окрашенное гематоксилин-эозином сечение сетчатки цыпленка показана справа. Рисунок получен на данных микроскопии палочек и колбочек у птиц в плоскости среза Ramуn y Cajal.RPE и относится к сетчатке глаза эпителия пигмента; ONL — внешний ядерный слой; INL — внутренний ядерный слой; GCL — слой клетки нервного узла.
• (B) — изображение в проходящем свете en:flatmounted P15 (номер рассматриваемых сечений сетчатки) стороны колбочек в сетчатке цыпленка. Рассматривался в срезах с шагом 10мкм, с помощью флюоресцентного микроскопа. Наноскоп (микроскоп с большим разрешением) — лабораторная оптическая система для получения увеличенных изображений малых объектов с разрешающей способностью 1‒10нм, с использованием различного характера свечения малых структурных элементов объекта под действием возбуждающего лазерного облучения. Микроскоп используется для исследования частиц, живых клеток, вплоть до молекул, с выдачей оцифрованных цветных в 3D пространстве стереизображений на экран монитора.
• (С) — Свечение синим цветом у колбочек, вызванное действием ультрафиолетовых лучей (327 нм); коротковолновая флюоресценция.
• (D) — Свечение зелёным цветом, вид колбочек под действием синего света (460—490 нм).
• (E) — Свечение красным цветом, вид колбочек под действием зелёного света (529—550 нм) .
• (G) — Переведенные в цифровую форму версии области, показанные на фото (B).

Дополнительно зеленые колбочки и двойные колбочки также флюоресцируют при освещении их синим светом. Только красные колбочки флюоресцируют под действием зеленого луча.

• (F) — Таблица, суммирующая появление липофильных капелек у цыпленка, в проходящем свете, и флуоресцентное освещение.

Рис.1 Капля масла (жировые или нефтяные капельки) определяют классификацию фоторецепторов колбочек цыпленка.

Открытие фоторецептора ipRGC

В 2007 году было обнаружено, что в области сетчатки, где расположены ганглионарные нейроны, залегающие в глубине сетчатки, расположен особый тип нервных клеток, фоторецепторы ганглиозного слоя сетчатки ipRGC. Эти клетки функционально связанны с палочками, колбочками и мозгом, они частично обуславливают реакцию на воздействие коротковолновой части спектра (460‒484 нм), непосредственно не лежащие в фокальной поверхности колбочек и палочек (см. рис.2, 4), которые рефлекторно связанны прямой и обратной связью с палочками и колбочками, и сквозь слой нервных волокон, с мозгом. Потому свет, прежде чем попасть на светочувствительные элементы внешних мембран палочки и колбочки, должен пройти через слой ганглиозных нейронов ipRGC, которые одновременно являются дополнительным светофильтром, отсекающим губительное для тканей и рецепторов проникновение ультрафиолетовых лучей из УФ области спектра. Пигмент меланопсин (версия Миг), чувствительный к фиолетово-синему участку спектра, благодаря связям с колбочками, палочками и мозгом, через фоторецепторы ipRGC участвует в работе колбочек и палочек, и в восприятии лучей S, а также в случае прямого попадания солнечных лучей и лучей электродуговой сварки в глаз мгновенным закрыванием ресниц, а также подавлением функции восприятия фиолетово-синих лучей мембраной колбочек и палочек в оппонентном отборе сине-жёлтого участка спектра. (См., например, Особенность работы S-колбочек сетчатки глаза).

Рецепторный уровень фототрансдукции нервных сигналов

Фоторецепторы и нейроны сетчатки глаза (Свет снизу)

Рис. Р. RPE — РПЕ, Ретинальный пигментный эпителий сетчатки глаза OS — Наружный сегмент экстерорецепторов IS — Внутренний сегмент фоторецепторов ONL — Внешний зернистый слой — Внешний ядерный слой OPL — Внешний сплетениевидный слой сетчатки глаза INL — Внутренний ядерный слой IPL — Внутренний сплетениевидный слой сетчатки глаза GC — Ганглионарный слой BM — Мембрана Бруха P — Пигментные эпителиоциты C — Колбочки сетчатки глаза R — Палочки сетчатки глаза Стрелка и пунткирна линия — внешняя пограничная мембрана H — Горизонтальные клетки сетчатки глаза Bi — Биполярные клетки сетчатки глаза M — Клетки Мюллера A — Амакриновые клетки (версия Миг) G — Ганглиозные клетки ipRGC Ax — Аксоны

Рис. 1/1. Свет сверху. Схема слоёв поперечного сечения сетчатки глаза. Область слоя ганглиозных клеток фоторецепторов ipRGC (cм. также рис.Р) — G.

Рис. 2/2. Принципиальная схема организации цветного зрения (на примере сетчатки цыплёнка).
А. Фоторецептор-колбочка. Свет проходит сквозь хрусталик и до пигментов колбочки расположенных на её «дне».
Б.1-Б.4 У птиц обычно четыре типа колбочек (они «тетрахроматы») и на рисунке видны четыре цвета, сфокусированные на внешней мембране колбочки цыплёнка на разной высоте в зависимости от цвета луча, что позволяют им синтезировать многоцветное изображение, и различать цвета лучше, чем человек. Обработка полученных разностных сигналов, происходящая в нейронной сети сетчатки (десятки типов клеток) обеспечивает возможность ясного различения тысяч цветов и оттенков.

Рецепторный уровень зрительной фототрансдукции или фототрансдукция в палочках и колбочках в сетчатке глаза — физиологический процесс создания и трансформации биохимических нервных сигналов при формировании оптического изображения в процессе зрения позвоночных животных. Процесс этот начинается от захвата фотонов сетчаткой глаза, и завершается формированием зрительных образов в зрительной коре головного мозга.

Рис.1.

Важное биологическое значение фоторецепторов состоит в том, что они преобразуют свет (версия Миг) (видимое электромагнитное излучение) в сигналы, которые могут стимулировать биологические процессы. Боле конкретнее, это — способность фоторецепторных белков в клетке поглощать фотоны, вызывая в клетке потенциал в том числе и мембранный потенциал. (Cм. также Фотохимические реакции).

Формирование оптического изображение в процессе зрения у позвоночных животных связано с находящимися к сетчатке глаза фоторецепторных клеток — экстерорецепторов колбочек (cone), у которых во внешних мембранах находится фотопигмент Йодопсин (версия Миг) и палочек (rod) с фотопигментом родопсином. Колбочки и палочки в то же время работают при участии ганглиозных фоторецепторов ipRGC, расположенных в сетчатке вне фокальной поверхности, которые непосредственно не формируют оптическое изображение, но принимают участие в работе колбочек и палочек. Палочки специализированы для «низко-легкого» зрения. Они чрезвычайно чувствительны и могут сигнализировать поглощение одиночных фотонов. Колбочки обеспечивают видения дневного света (иллюстрация 1). Они намного менее чувствительны к свету, чем палочки, но обладают более длительным временным восприятием. Они обеспечивают цветное зрение благодаря способности колбочек воспринимать сфокусиванные на них лучи света из-за изменчивых фотопигментов у них, чувствительных к различным спектральным лучам (См. Опсины (версия Миг)).

• Рис. 1. Светлопольные изображения фоторецептора палочки и фоторецепторов колбочки, изолированных от сетчатки саламандры. Фототрансдукция имеет место во внешней доле, в то время как эллипсоид плотно упакован mitochondria. Палочки ответственны за тусклое легкое видение, колбочки для видения яркого света.

Имеются большие достижения в понимании фототрансдукции палочки. Начиная с введения электрода всасывания, позволяющего производить запись техники при экспериментах в конце 1970-ых (Baylor и др., 1979a). Фоторецепторы человека, земноводных и относящиеся к млекопитающим (включая примата), могут быть использованы для исследоаний этим методом. Бычья сетчатка, с другой стороны, была любимой при подготовке к тому, чтобы изучить фототрансдукцию биохимиками из-за изобилия доступной ткани. Мышь, однако, стала более популярной моделью животных для исследования в прошлом десятилетии при помощи появившихся планируемых генных методов. Когда это объединено с электрофизиологией, генетика мыши обеспечивает непревзойденную власть в объяснении в естественных условиях функции ключевых белков фототрансдукции, большинство которых было выбито, сверхвыражено или видоизменено в колбочках, приводя к богатому объему информации на принципах, лежащих в основе увеличения, восстановления и адаптации фотоответов палочка/колбочка (Таблица 1, рис. 2,3).

Таблица 1.

Таблица 1. Список главных белков (см. G-белки), вовлеченных в палочке мыши и фототрансдукции колбочки, которые были выбиты, сверхвыражены или mutated1 1) из-за высокого ограничения, но не все генетически проектируемые линии мыши перечислены. Для включенных только перечислены самые существенные фенотипы (в тексте дано более полное описание). 2) Arrestin4 также называют колбочкой-arrestin или X-arrestin (Gurevich и Gurevich, 2006; Никонов и др., 2008) 3) сверхвыражение RGS9‒1 было достигнуто сверхвыражением R9AP, который привел к сверхвыражению всех трех компонентов комплекса ПРОМЕЖУТКА, RGS9‒1, G_5-L и R9AP.

Сначала даётся краткое описание структуры и развития фоторецепторов мыши, сопровождаемых резюме недавних исследований фототрансдукции палочки с акцентом на информацию, подбираемой от образцов мыши. В конце, будет упомянут недавний прогресс в обучающихся колбочках мыши.

На основании опубликованных данных исследований профессора департамента офтальмологии функциональной нейроанатомии сетчатки R.E.Marcа (2009), то ещё в 1966 году при электронной, рентгеновской микроскопии сетчатки полученные данные «синих» колбочек приматов, что не совападает с данными С.Ременко на базе его исследований на модели глаза (колориметре), где вместо живых ячеек (колбочек и палочек) сетчатки использованы фототранзисторы и утверждается, что в сетчатке глаза в восприятии цвета участвуют блоки только из двух фоторецепторов «палочка+колбочка» (1975). Больше того, рентгеноскопия сетчатки глаза (см. фиг.) ещё в 1966 R.E.Marcом показывает связи колбочек и палочек и фоторецепторов ipRGC, где палочки и колбочки работают независимо и просматривается трёхкомпонентая структура связей колбочек RGB и ячеек ганглиозного слоя.

При том, по мере удаления блоков от центра жёлтого пятна, центральной ямки фовеа, меняются мозаика распределения фоторецепторов, расстояние между фоторецепторами и размеры самих фоторецепторов. Например, на периферии (в зоне периферийного зрения) практически в группах одни палочки. (См., например, Центральная ямка сетчатки глаза (версия Миг)).

Также в результате флюоресценции жировых капелек колбочек, где проходят процессы формирования и накопления сигналов (цветов), посылаемых в мозг, то уже на этом этапе (в сетчатке) происходит выделение и оппонентная обработка базовых биосигналов S,M,L у человека до поступления их в зрительные отделы (нейронный уровнь) головного мозга. Т.е. выделенные базовые биосигналы S,M,L (синий, зелёный, красный) определили многокомпонентную теорию цветного зрения. Откуда, например, у человека и некоторых приматов выделяется три базовых цвета (RGB) — «трихроматизм», у птиц основные цвета (RGBV) (красный, зелёный, синий, фиолетовый) — четыре — «четырехроматизм» (см. Цветное зрение у птиц (версия Миг)).

Рис. 10;Гистология колбочек и палочек цыпленка при флюоресцентной микроскопии

Данные иссдедования (2006 год) поставили на свои места целый ряд гипотез и предположений, противоречащих одна другой. При этом сформировано общее направление трёх и более компонентной теории цветного зрения — что существует процесс трех или более компонентного восприятия цвета на 2-х уровнях: на уровне низших отдедов зрительной системы — сетчатки совместно с клетками зрительной нервной системой головного мозга (принципы оппонентного цветового зрения), которые как позже выяснилось дополняют друг друга.

Рис.14a. Для трёх разновидностей колбочек (cones) дан принцип так называемого трехцветного дневного видения (трихроматиз) у приматов, который также имеется у большинства людей. Т.е. к длинным волнам чувствительны L-колбочки (красный цвет), как известно они максимально чувствительны к длинам волн максимума вокруг 559 нм, к средним волнам чувствительны M-колбочки (зелёный цвет) с пиком вокруг 531нм и к коротким волнам — S-колбочки (синий цвет) с пиком-419 нм. Палочки чувствительны к длинам волн максимума вокруг 496нм и менеее. Палочки (rod) даны точечной кривой, т.к. в цветном зрении они не участвуют (cм. также Ретиномоторная реакция фоторецепторов сетчатки глаза).

Проходящие через расположенные перед фоторецепторами капилляры лейкоциты, при просмотре в синем свете могут восприниматься как мелкие светлые движущиеся точки. Данное явление известно как энтопический феномен синего поля (или феномен Ширера)

Рис. 1a. Строение колбочки (сетчатка глаза).
1 — мембранные полудиски;
2 — митохондрия;
3 — ядро (эллипс с жировой каплей);
4 — синаптическая область;
5 — связующий отдел (перетяжка);
6 — наружный сегмент;
7 — внутренний сегмент;
8 — граница мембранной части;
9 — пигмент сократимых фибрилл.

Рис. 2b. Строение палочки сетчатки глаза:
1 — наружный сегмент (содержит мембранные диски),
2 — связующий отдел (ресничка),
3 — внутренний отдел (содержит митохондрии),
4 — осноание с нервными окончаниями,
5 — граница мембранной части,
6 — ядро,
7 — синаптическая область.

Кроме экстерорецепторных R, C (см. также рис. 1a, 2b) и фоторецепторных ганглионарных клеток в сетчатке G присутствуют и биполярные нервные клетки Bi, которые располагаясь между первыми и вторыми уровнями, осуществляют между собой контакты, а также имеющиеся горизонтальные H и амакриновые клетки A, которые осуществляют горизонтальные связи в сетчатке глаза (см. рис.Р).

Между слоем ганглионарных клеток и слоем палочек и колбочек находятся два слоя сплетений нервных волокон со множеством синаптических контактов. Это внешний плексиформный (сплетеневидный) слой OPL и внутренний плексиформный (сплетеневидный) слой IPL. В первом осуществляются контакты между палочками и колбочками посредством вертикально ориентированных биполярных клеток, во втором — сигнал переключается с биполярных на ганглионарные нейроны, а также на амакриновые клетки в вертикальном и горизонтальном направлении.

Таким образом, наружный нуклеарный слой сетчатки содержит тела фотосенсорных клеток колбочек и палочек (фокальная поверхность), внутренний нуклеарный слой содержит тела биполярных, горизонтальных и амакриновых клеток, а ганглионарный слой содержит фоторецепторы ipRGC  ганглионарные клетки сетчатки, которые своими синапсами связаны с колбочками и палочками, а также с головным мозгом, которые при помощи обратной связи управляют колбочками и палочками. Также имеется небольшое количество перемещённых амакриновых клеток. Все слои сетчатки пронизаны радиальными глиальными клетками Мюллера. При этом указанные связи клеток сетчатки между собой и фоторецепторами обеспечивают способность нашей зрительной системе осуществлять цветное зрение при дневном освещении колбочками и при сумеречном и ночном освещении — палочками.

Наружная пограничная мембрана Ax образована из синаптических комплексов, расположенных между фоторецепторным и наружным ганглионарным слоями. Слой нервных волокон образован из аксонов ганглионарных клеток. Внутренняя пограничная мембрана образована из базальных мембран мюллеровских клеток M, а также окончаний их отростков зон INL, ONL. Лишённые шванновских оболочек аксоны ганглионарных клеток, достигая внутренней границы сетчатки, поворачиваются под прямым углом и направляются к месту формирования зрительного нерва к зоне сетчатки глаза, около ямки фовеа слепого пятна.

Каждая сетчатка у человека содержит около 6—7 млн колбочек и 110—125 млн палочек. Эти светочувствительные клетки распределены неравномерно. Центральная часть сетчатки содержит больше колбочек, периферическая содержит больше палочек. В центральной части пятна в области ямки колбочки имеют минимальные размеры (с диаметром около 2‒3мкм) и мозаично упорядочены в виде компактных шестигранных блоков, но по мере центробежного удаления мозаика меняется в сторону увеличения зон блоков, в которых одноимённые колбочки, например, фиолетовые (у птиц), строго по системе равномерного распределены и также по упорядоченой системе окружаются другими колбочками.

Выводы

Майкл Х.Роу, Нейробиология

В обзоре профессора, доктора философии, Университета Калифорнии, Прибрежной полосы Нейробиология Майкла Х. Роу, выдвинуто на первый план недавнее продвижение понимания трех аспектов видения цвета Trichromaticy en:Trichromacy у приматов (2002г):

• 1) поведенческое значение trichromacy,
• 2) развитие и генетика фотопигментов,
• 3) относящиеся к сетчатке глаза кругообороты, которые создают красно-зеленые и синие-желтые цветные каналы в зрительном нерве.

Большинство дневных позвоночных животных воспринимают видимую часть спектра в диапазоне длин волн между ~400 и ~650 нм. Естественные объекты этот диапазон длин волн не отражают их в равной пропорции, и таким образом свет в различных пунктах поперек изображения может измениться по спектральному составу так же как и интенсивность (не равномерно). Откуда, спектральное содержание естественных изображений является богатым источником информации о естественной окружающей среды обитания. Спектр чисто земных изображений может быть в виде двух основных компонентов:

• Один компонент — представляет цветной контраст между короткими и средними длинами длин волн спектра (S-M);
• Второй компонент — цветной контраст между средними и длинными частями длины волны спектра (M-L).

Для примата, чтобы извлечь и использовать эту информацию должна быть:

• 1) Соответственно выбрана видимая часть соответствующей области длины волны;
• 2) Морфология (схема) сетчатки глаза долхна приспосабливаться, воспринимать спектральную информацию и быть эффективно переданной в мозг.

Животные, приматы (включая человека), визуальные системы которых отвечают этим требованиям, наделены способностью воспринимать цвет — цветным зрением (см. Цветное зрение).

См. также

• Механизмы цветовосприятия у приматов (версия Миг)
• Теория оппонентного цветного зрения (версия Миг)
• Современный взгляд на световосприятие и цветное зрение (версия Миг)
• Теория трёхкомпонентного цветного зрения (версия Миг)

Примечания

1. перенаправление шаблон:цвета радуги